多重荧光免疫组化

1. 多重荧光免疫组化——酪胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术

TSA技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。类似常规免疫组化的DAB显色法[3]，TSA（Tyramide signal amplification）技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

酪胺信号放大技术原理

多重荧光免疫组化染色流程图

多荧光免疫组化结果展示

2.Pull down与免疫共沉淀（CO-IP）技术：Pull down的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

免疫共沉淀（CO-IP）的原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。